: يك روش دقيق * دكتر منيژه متوليانI دكتر عفت سوريII دكتر نيوشا تفرشيIII دكتر حسن جلاليزادهIV دكتر مسعود محموديانV چكيده كروماتوگرافي با كاركرد عالي زمينه و هدف: درمانهاي جايگزين كليه اغلب با تغييرات عناصر كمياب و متابوليسم ويتامينها هم ر اه اس ت. تجويز مولتيويتامينها به بيماران دياليزي به صورت روتين در مراكز دياليز صورت ميگيرد. غلظت پلاسمايي تيامين نشانگر خوبي براي وضعيت تغذيهاي بيمار است. در اين مطالعه يك روش دقيق كروماتوگرافي با كاركرد عالي براي تعيين غلظت پلاسمايي تيامين در انسان راهاندازي شده و غلظت پلاسمايي تيامين در گروهي از بيماران همودياليزي بررسي شده است. هدف از انجام اين پژوهش اندازهگيري ميزان تيامين در خون بيماران همودياليزي مزمن به منظور ارزيابي نياز يا عدم نياز اين بيماران به مكملهاي حاوي تيامين است. روش بررسي: در اين مطالعه تجربي پلاسماي 9 نفر بيمار همودياليزي ايراني براي تعيين ميزان تيامين آن آناليز شده و با يك گروه داوطلب سالم ايراني مقايسه شد. طريقه عمل بر اساس اكسيداسيون تيامين قبل از ورود به ستون و تبديل آن به تيوكروم و سپس رديابي توسط ردياب فلورسنت بود. 1 ميليليتر از پلاسما توسط تريكلرواستيك اسيد دي پروتي ينه شده و تيامين توسط دياتيل اتر استخراج شد. سپس سيانوژن برومايد (0/ ميليليتر) اضافه شد تا تيامين را به تيوكروم تبديل كند. نمونهها (25 ميكروليتر) به يك ستون mm) Novapak C 8, 4 μm (4/6 250 تزريق شد. فاز متحرك شامل متانول: بافر فسفات 0) ميليمولار) با نسبت 55:45 و % 0/05 سديم لوريل سولفات بود. نتايج به دست آمده با استفاده از Student t-test و ANOVA يك طرفه آناليز شد. آناليز اطلاعات با استفاده از برنامه.V 1 SPSS صورت گرفته است. يافتهها: نتايج نشان ميدهد كه روش استفاده شده براي تعيين مقدار تيامين در پلاسما روشي بسيار دقيق و تكرارپذير است. حداقل مقدار قابل اندازهگيري تيامين 0/2 نانو گرم در ميليليتر و درصد بازيافت حدود %85 بوده است. ضراي ب تغييرات بين روزي و درون روزي براي غلظت اختياري تيامين در پلاسما در محدوده %0/22-2/94 بود. ميانگين غلظت پلاسمايي تيامين در 10 نفر داوطلب سالم ±0/95 /07 نانوگرم در ميليليتر و در بيماران 4/72±1/12 نانوگرم در ميليليتر قبل از همودياليز و 4/29±0/67 نانوگرم در ميليليتر بعد از همودياليز بود. مطالعه حاضر نشان ميدهد كه ميانگين غلظت پلاسمايي تيامين در بيماران همودياليزي ايراني تفاوت معنيداري با داوطلبين سالم ايراني ندارد و همچنين قبل و بعد از دياليز نيز تغيير چنداني نمي كند. نتيجهگيري: روش استفاده شده براي اندازهگيري تيامين در پلاسما روشي حساس دقيق و تكرارپذير است و براي مطالعات كينتيكي تيامين مناسب است. بر اساس يافتههاي اين تحقيق ميتوان چنين نتيجه گرفت كه بيماراني كه ب ه صورت مزمن تحت همودياليز قرار ميگيرند تفاوت معنيداري در مورد غلظت تيامين با افراد سالم ندارند و ميزان ويتامين موجود در رژيم غذايي اين افراد براي رفع نياز بدن كافي به نظر ميرسد و دريافت ويتامين اضافي توسط اين بيماران ضروري نيست. كليدواژهها: 1- تيامين 2- كروماتوگرافي با كاركرد عالي - غلظت پلاسمايي 4- همودياليز مقدمه نارساي ي حاد كليه يكي از مشكلات جدي است كه افرادي كه به سختي بيمارند در معرض آن ميباشند و گاهي نياز به روشهاي جايگزيني كليه پيدا ميكنند كه عناصر كمياب و متابوليسم (1) ويتامينها را تغيير ميدهد. بيماراني كه بهطور مزمن تحت (1-) دياليز هستند مستعد آنسفالوپاتي با علت ناشناخته ميباشند. در بيماران كليوي تحت دياليز احتمال كمبود تيامين وجود دارد اين مقاله تحت حمايت مالي مركز تحقيقات علوم دارويي رازي و معاونت پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي ايران (طرح شماره 85 مت)/ انجام شده است. همچنين اين تحقيق در سال 185 در كنگره بينالمللي فيزيولوژي و فارماكولوژي (IUPHAR) در كشور چين پكن اراي ه شده است. I) استاديار گروه فارماكولوژي دانشكده پزشكي تقاطع بزرگراه شهيد همت و چمران دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني ايران تهران ايران (*مولف مسو ول) (II دانشيار گروه شيمي دارويي دانشكده داروسازي و مركز تحقيقات علوم دارويي دانشگاه علوم پزشكي تهران تهران ايران (III دكتراي عمومي داروسازي دانشگاه آزاد اسلامي تهران ايران (IV استاديار گروه شيمي دارويي دانشكده داروسازي و مركز تحقيقات علوم دارويي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني تهران تهران ايران V) استاد گروه فارماكولوژي دانشكده پزشكي تقاطع بزرگراه شهيد همت و چمران دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني ايران تهران ايران 177 دورة پانزدهم / شماره 60 و / 61 پاي يز و زمستان 187
(1-) كه علاي م شبيه آنسفالوپاتي ايجاد ميكند. مطالعات نشان داده است كه تجويز تيامين نشانههاي آنسفالوپاتيورنيكه را به طور ) و 4 (5 كامل از بين ميبرد. به منظور ارزيابي ضرورت تجويز تيامين به بيماران همودياليزي اندازهگيري غلظت پلاسمايي تيامين در 9 بيمار همودياليزي انجام گرفته و با افراد سالم كه فرآوردههاي دارويي حاوي ويتامين دريافت نميكنند مقايسه شد. تعيين غلظت تيامين توسط روشهاي متعدد آنزيمي (6-11) شيميايي و ميكروبيولوژيكي صورت ميگيرد ول ي ب ه نظ ر ميرسد كه اندازهگيري مستقيم با كروماتوگرافي با كاركرد عالي (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) ( 12 و 1 ) مناسبتر باشد. هدف از انجام اين پژوهش ابتدا راهاندازي يك روش دقيق و حساس براي اندازهگيري تيامين با HPLC و سپس ارزيابي اين روش با اندازهگيري سطح پلاسمايي تيامين در بيماران همودياليزي و مقايسه آن با داوطلبين سالم ايراني در جهت تعيين نياز يا عدم نياز اين بيماران به مكملهاي حاوي تيامين است. روش بررسي در اين مطالعه تجربي از طريق اكسيداسيون تيامين قبل از ورود به ستون و تبديل آن به تيوكروم و سپس رديابي آن توسط ردياب فلورسنت شناسايي صورت گرفت. تهيه محلولهاي استاندارد محلول استاندارد تيامين هيدروكلرايد در آب مقطر با غلظت 1 ميلي گرم در ميليليتر تهيه شد و به صورت سريال رقيق شده تا غلظتهاي 1000 500 200 100 و 1500 نانوگرم در ميليليتر ب ه دست آيد. غلظت اصلي در 4 نگهداري شد. يخچال با o C روش استخراج تيامين به يك ميليليتر پلاسما تري كلرواستيك اسيد (%40 125 ميكروليتر) اضافه شده و براي 20 ثانيه ورتكس شد. مخلوط 0 دقيقه در يخچال نگهداري شده و سپس با دور 4500rpm براي 15 دقيقه سانتريفوژ شد. به 500 ميكروليتر از مايع رويي ميليليتر دياتيل اتر اضافه شده و 0 ثانيه ورتكس شده و سپس با دور 4000rpm بر ا ي 5 دقيقه سانتريفوژ شد. لايه دياتيل اتر دور ريخته شد و 200 ميكروليتر از لايه زيرين به لوله جديدي منتقل شد و س يانوژن بروماي د (0/ مولار 20 ميكروليتر) اض افه گرديد و 10 دقيقه در حرارت اتاق گذاشته شد تا تيامين را به تيوكروم تبديل كند. سود 1 مولار (20 ميكروليتر) اضافه و براي 1 دقيقه ورتكس شد و 25 ميكروليتر از آن به ستون HPLC تزريق گرديد. شرايط كروماتوگرافي آناليز تيامين با يك روش فاز معكوس شامل پمپ Waters مدل 510 با كنترلكننده تزريقكننده اتوماتيك Waters مدل 717 و ردياب فلورسنت Waters مدل 474 صورت گرفت. ستون Novapak C 8 با ابعاد 4/6 250 ميليمتر استفاده شد و فاز متحرك شامل متانول: بافر فسفات (0 ميليمولار (ph=6/9 با نسبت 55:45 و %0/05 سديم لوريل سولفات بود. قبل از مصرف فاز متحرك با فيلتر 0/45 ميكرون فيلتر شد و در تمام طول كار گاز هليم درآن دميده شد. سرعت جريان فاز متحرك 1 ميليليتر در دقيقه و حجم تزريق 25 ميكروليتر بود. طول موج ردياب فلورسنت براي تحريك 65 نانومتر و براي صدور 45 نانومتر بود. تمام تزريقها در درجه حرارت آزمايشگاه صورت گرفت. بازيافت مقادير معلومي از تيامين هيدروكلرايد به پلاسماي عاري ازداروي (بلانك) انسان اضافه شد تا غلظتهاي 10 2 و 15 نانوگرم در ميليليتر تهيه شود. سپس فرآيند استخراج صورت گرفت و حجمهاي لازم به ستون HPLC تزريق شد. سطح زير منحني حجمهاي برابر از غلظتهاي استخراج شده و استخراج نشده با هم مقايسه گرديد. براي هر غلظت استخراج شده و استخراج نشده نوبت محلول تهيه گرديد. كاليبراسيون دقت و صحت آزمايش منحني كاليبراسيون حاوي تيامين هيدروكلرايد در دورة پانزدهم / شماره 60 و / 61 پاي يز و زمستان 187 178
محدوده 1-15 نانوگرم در ميليليتر در پلاسما رسم شد. استانداردهاي كاليبراسيون با اضافه كردن 20 ميكروليتر از محلولهاي استاندارد تيامين هيدروكلرايد به 1 ميليليتر پلاسماي بلانك انسان براي به دست آوردن غلظتهاي نهايي 10 5 2 1 و 15 نانوگرم در ميليليتر تهيه شد. سپس فرايند استخراج انجام شد. سطح زير منحني تيامين هيدروكلرايد در غلظتهاي مختلف براي رسم منحني استاندارد استفاده گرديد. دقت و صحت درون روزي با استفاده از سه غلظت مختلف در پلاسماي بلانك انسان (1 5 و 15 نانوگرم در ميليليتر) تعيين شد و هر غلظت سه بار تكرار شد. همين عمل سه بار با فاصله چند روز براي محاسبه ضراي ب تغييرات بين روزي تكرار گرديد. دقت روش با ضريب تغييرات CV) (Coefficient of Variation - سنجيده شد كه به شكل زير محاسبه گرديد: Standard deviation %CV = 100 Mean measured concentration و درصد عدم صحت error) %) نيز به روش زير محاسبه شد: (Measured concentration -Expected concentration) Mean % error = 100 Expected concentration آمادهسازي نمونههاي انساني به منظور آزمودن روش كروماتوگرافي تهيه شده در اندازهگيري تيامين در پلاسما نمونههاي خوني از 9 بيمار همودياليزي مزمن (7 مرد و 2 زن) با ميانگين سني 22±0/28 سال قبل و بعد از همودياليز و همچنين از 10 داوطلب سالم مرد ) با سن 20-0 سال) كه هيچ فرآورده دارويي حاوي ويتامين مصرف نميكردند گرفته شد. پروتكول آزمايش توسط كميته اخلاقي مركز تحقيقات دارويي رازي تاييد شده و تمامي داوطلبين رضايتنامه كتبي حاكي از رضايت براي شركت در اين تحقيق امضا كردند. نمونههاي خوني بلافاصله سانتريفوژ شده و در فريزر 20- درجه سانتيگراد تا زمان آزمايش نگهداري شدند. آناليز اطلاعات با استفاده از برنامه (1 SPSS (version و با استفاده از ميانگين و خطاي معيارصورت گرفته است. در آناليز تحليلي نتايج به دست آمده از داوطلبين سالم و بيماران همودياليزي قبل و بعد از دياليز از طريق آزمون Student t-test و آناليز واريانس يك طرفه مورد آزمون قرار گرفته و 0/05>p معنيدار تلقي شده است. يافتهها غلظتهاي سر مي تيا مي ن پس از مشت قسازي توسط سيانوژن برومايد كه تيامين را به تيوكروم تبديل ( 14 و 15 ) كرد با استفاده از روش كروماتوگرافي ذكر شده اندازهگيري شد. در طيف غلظت 1 تا 15 نانوگرم در ميليليتر بر اساس 5 نقطه اندازهگيري شده منحني استاندارد خطي بوده و از 2 ضريب رگرسيون بالايي برخوردار است( 0/996 = r) (شكل شماره 1). زمان باز داري تيامين در ستون حدود 4/7 دقيقه بود (اشكال شماره 2-5). شكل شماره 2 كروماتوگرام حاصل از تزريق پلاسماي بلانك انسان با 10 نانوگرم تيامين اضافه شده در آن را نشان ميدهد. اشكال شماره و 4 يك نمونه از كروماتوگرام حاصل از تزريق پلاسماي بيماران قبل و بعد از همودياليز را نشان ميدهد. شكل شماره 5 كروماتوگرام حاصل از تزريق پلاسماي يكي از داوطلبين سالم را نشان ميدهد. ارزيابي روش حاصل نشان ميدهد كه روش حاضر از دقت كافي با ضريب تغييرات درون روزي و بين روزي بين %0/85-2/94 براي سه بار تكرار در محدوده غلظت 1-15 نانوگرم در ميليليتر برخوردار است (جداول شماره 1 و 2). ميانگين بازيافت تيامين در اين روش در سه غلظت مختلف %85±/4 بوده است. حداقل غلظت قابل اندازهگيري 0/2 نانوگرم در ميليليتر است. ميانگين مقادير تيامين در پلاسماي بيماران بعد از همودياليز (4/29±0/67) در مقايسه با قبل از همودياليز (4/72±1/12) كمتر بود اما تفاوت معنيداري با افراد سالم (/7±0/68) نداشت (0/05>p). اشكال شماره 6 و 7 179 دورة پانزدهم / شماره 60 و / 61 پاي يز و زمستان 187
يافتههاي مربوط به بيماران و افراد سالم و چگونگي توزيع آن را نشان ميدهد. Downloaded from rjms.iums.ac.ir at 10:26 IRST on Tuesday September 25th 2018 شكل شماره 1- منحني استاندارد تيامين هيدروكلرايد در پلاسما (9=n) شكل شماره 2- كروماتوگرام پلاسماي بلانك انسان با 10 نانوگرم در ميليليتر تيامين افزوده شده (1- تيامين). شكل شماره 4- نمونه كروماتوگرام پلاسماي بيمار بعد از همودياليز ( 1 -تيامين) شكل شماره 5- نمونه كروماتوگرام پلاسماي يكي از داوطلبين سالم (1- تيامين) شكل شماره - نمونه كروماتوگرام پلاسماي بيمار قبل از همودياليز (1- تيامين) شكل شماره 6- غلظتهاي تيامين (بر حسب نانوگرم در ميليليتر) در پلاسماي گروههاي بيماران و كنترل دورة پانزدهم / شماره 60 و / 61 پاي يز و زمستان 187 180
شكل شماره 7- چگونگي توزيع غلظتهاي تيامين (برحسب نانوگرم در ميليليتر پلاسما) در گروه بيماران و كنترل (1- قبل از همودياليز 2- بعد از همودياليز و - افراد سالم) جدول شماره 1- ضرايب تغييرات بين روزي در اندازهگيري تيامين تيامين هيدروكلرايد دفعات تكرار غلظت اندازهگيري شده (ميانگين ± ضريب تغييرات% درصد عدم صحت خطاي استاندارد) ng/ml غلظت افزودهشده (نانوگرم در ميليليتر) ng/ml 1 1/02±0/0 1/05±0/0 1/05±0/02 4/66±0/05 4/46±0/01 4/71±0/08 15/0±0/15 15/7±0/06 15/1±0/14 2/94 2/86 1/90 1/07 0/22 1/70 1/24 0/9 0/91 2 5 5-6/8-10/8-5/8 2 2/5 2/1 روز اول روز دوم روز سوم 5 روز اول روز دوم روز سوم 15 روز اول روز دوم روز سوم جدول شماره 2- ضرايب تغييرات درون روزي در اندازهگيري تيامين غلظت تيامين هيدروكلرايد افزودهشده (نانوگرم در ميليليتر) دفعات تكرار غلظت اندازهگيري شده (ميانگين ± خطاي استاندارد) ضريب تغييرات% درصد عدم صحت 1 5 15 ng/ml 1/04±0/0 4/61±0/12 15/±0/17 2/88 2/60 0/85 4-7/8 2/2 بحث فعاليت آنزيم ترانس كيتولاز در اريتروسيتها هنوز ب ه عنوان نشانگر ميزان تيامين بدن مورد استفاده قرار (16) ميگيرد. ب ه طور كلي فعاليت پايينتر از نرمال آنزيم و افزايش اين فعاليت با تجويز مقادير زياد تيامين دي فسفات نشاندهنده كمبود تيامين است (اين پديده به اثر تيامين دي فسفات مشهور است). آزمون ترانس كيتولاز كه يك نشانگر غيرمستقيم ميزان تيامين بدن است با محدوديتهايي همراه است. استاندارد كردن آن (17) مشكل است بيماري كبد ميتواند توليد آپو آنزيم و (18) فسفريلاسيون آن را مختل كند. برخي وارياسيونهاي آپو آنزيم نشان داده شده است كه تمايل كمتري براي تيامين دارند و بنابراين اثرات تيامين دي فسفات كمتر (19) مشاهده ميشود. كمبود طولاني مدت تيامين ممكن است منجر به كاهش توليد آپو آنزيم شده و اثر تيامين (20) دي فسفات را كاهش دهد ب ه صورتي كه مقادير كم به طور دقيق منعكسكننده غلظت تيامين نيست بلكه سطح (21) پايين آپو آنزيم را نشان ميدهد. اين مشكلات در تفسير نتايج ميتواند منجر به انحراف در تخمين مقادير تيامين شود. به علت غير دقيق بودن اين روشها روشهاي كروماتوگرافي براي اندازهگيري تيامين مطرح شد كه در نهايت اندازهگيري مستقيم تيامين در گلبوله يا قرمز را توسط كروماتوگرافي با كاركرد عالي مقدور (18) ساخت. جداسازي تيامين با كروماتوگرافي پديده تازهاي نيست. لوين و واي در 1966 با كروماتوگرافي (22) كاغذ استرهاي تيامين را جدا كردند. بعدها روش كروماتوگرافي لايه نازك كروماتوگرافي گازي و كروماتوگرافي مايع نيز براي جداسازي تيامين مورد (2-25) استفاده قرار گرفت. اكسيداسيون قليايي تيامين كه باعث ايجاد تيوكروم كه شديدا فلورسنت است ميشود (26) اولين بار توسط برگر و همكاران در 195 بيان شد. واكنش اكسيداسيون تحت شرايط خاصي سريع است و (27) در كمتر از 15 ثانيه كامل ميشود. اين واكنش پايه ( 28 و 29 ) روش شيميايي اندازهگيري تيامين ميباشد. تعدادي معرف براي اكسيداسيون تيامين به تيوكروم استفاده 181 دورة پانزدهم / شماره 60 و / 61 پاي يز و زمستان 187
ميشود پتاسيم فري سيانيد ) 6 Fe(CN) K) كه مشهورترين آنهاست سيانوژن برومايد (BrCN) كه كار با آن ميتواند خطرناك باشد و مركوريك كلرايد ) 2 (HgCl كه شدت فلورسانس بيشتري توليد ميكند ولي به اندازه پتاسيم فري سيانيد پايدار نيست. اكسيداسيون قليايي پتاسيم فري سيانيد باعث تشكيل هيدروكسي اتيل تيامين ميشود كه اكسيداسيون با سيانوژن برومايد چنين (1) مشتقي را ايجاد نميكند كه اين تفاوت در اندازهگيري تيامين حاي ز اهميت است. انتخاب روش تشكيل تيوكروم قبل از ستون به اين دليل است كه در مقايسه با بعد از ستون پيكهاي تميزتري با كيفيت بهتر به دست ميآيد و (12) در عين حال نياز به وسايل اضافي ندارد. اگرچه در اكسيداسيون بعد از ستون اين امتياز وجود دارد كه چون ph مورد نياز براي اكسيداسيون تيامين بالاي 8 است و اين ph به ستون HPLC صدمه ميزند با اكسيداسيون بعد از ستوني عمر ستون با فاز متحرك قليايي طولانيتر خواهد بود. در روشهاي مدرن كروماتوگرافي با كاركرد عالي براي اندازهگيري تيامين اولين بار در 1978 روزر و همكاران در فاز نرمال تيامين را اندازهگيري (0) كردند. از اكسيداسيون قبل از ستون و با استفاده از پتاسيم فريسيانيد و رديابي با دتكتور فلورسنت جداسازي صورت گرفت. دقت جداسازي 0/0 ميكروگرم در ميليليتر بود كه درمقايسه با روش به كار گرفته شده در مطالعه حاضر از 150 برابر دقت كمتر برخوردار است (حد غلظت قابل اندازهگيري در مطالعه حاضر 0/2 نانوگرم در ميليليتر است). در 1984 بونتمپت با يك تكنيك (1) فاز معكوس تيامين را شناسايي كرد. تحت شرايط مورد استفاده پتاسيم فري سيانيد و NaOH تاثير زيادي بر سطح زير منحني و زمان بازداري تيامين دارند. در 1985 وبر و كويتز با روش فاز نرمال تيامين موجود (2) در پلاسما را اندازه گرفتند و بتندورف و همكاران با استفاده از روش فاز معكوس ايزوكراتيك اندازهگيري () كردند. زمان بازداري تيامين طولاني بود. امتياز اين روش استفاده از ستون PRP-1 بود كه نسبت به تغييرات ph از 1 تا 1 بسيار پايدار است و خرابي سريع ستون كه با ph بالا در ستونه يا silica based ديده ميشود () در اين ستون ديده نميشود. روشهاي متعدد كروماتوگرافي با كاركرد عالي اجازه آناليز سريع و اختصاصي تيامين در مايعات بيولوژيك را دادهاند. عليرغم روشهاي متعددي كه استفاده شده است انتخاب روشي براي آناليز تيامين در پلاسما براي مقادير بسيار كم (در حدود 1 نانوگرم در ميليليتر) بسيار مشكل بود. استفاده از اكسيداسيون قليايي براي تشكيل تيوكروم براي تعيين مقدار كمي تيامين بسيار حاي ز اهميت است كه در اين تحقيق براي اكسيداسيون از پتاسيم فري سيانيد قليايي و سيانوژن برومايد قليايي هر دو استفاده گرديد و از آنجايي كه نتايج ب ه دست آمده با سيانوژن برومايد از دقت بيشتري برخوردار بود از سيانوژن برومايد در محيط قليايي براي اكسيداسيون تيامين به تيوكروم استفاده گرديد. روش به دست آمده روشي حساس و دقيق براي اندازهگيري تيامين در پلاسماي انسان است. انتخابي بودن دقت و صحت روش (جداول شماره 1 و 2) و توانايي آن درسنجش غلظتهاي مورد انتظار در خون انسان (حد غلظت قابل اندازهگيري 0/2 نانوگرم در ميليليتر) به علاوه زمان بازداري كوتاه آن در ستون اين روش را روشي مناسب جهت پايش سطح تيامين در بيماران مزمن كليوي ميسازد. تجويز مولتيويتامينها براي بيماران دياليزي در مراكز دياليز به صورت روتين انجام ميشود. غلظت پلاسمايي تيامين نشانگري مناسب براي ارزيابي وضعيت تغذيهاي بيماران است. سطح پلاسمايي تيامين در گروهي از بيماران با استفاده از روش فوق تعيين گرديد. از محدوديتهاي اين پژوهش مشكل بودن تعيين غلظت تيامين در پلاسما بود كه به دليل كمبود امكانات با صرف وقت زياد صورت گرفت. اين مطالعه نشان ميدهد كه سطح ميانگين تيامين در دورة پانزدهم / شماره 60 و / 61 پاي يز و زمستان 187 182
بيماران ايراني همودياليزي به صورت معنيدار با داوطلبين سالم ايراني تفاوتي ندارد و سطح تيامين خون نيز بعد از همودياليز تغيير چنداني نداشته است. بنابراين نتيجه گرفته ميشود كه تجويز ويتامين به اين بيماران ضروري نيست و فقط زماني كه ميزان ويتامينهاي محلول در آب در اين بيماران كاهش يافته باشد در حد دوز روزانه مورد نياز و مقدار توصيه شده روزانه (Recommended Dietary 6- Esi Y, Koyaman S, Shikata H, Kawasaki K. Content of thiamin phosphate esters in mammalian tissues an extremely high concentration of thiamin 18 RDI) Intake - تجويز شود. نتيجهگيري روشهاي متعددي براي اندازهگيري تيامين در مايعات بيولوژيك با استفاده از كروماتوگرافي با كاركرد عالي گزارش شده است. روش حاضر در مقايسه با روشهاي موجود از حساسيت و دقت بيشتر و زمان بازداري كوتاهتر تيامين در ستون برخوردار است و براي پايش روتين تيامين در بيماران كليوي مناسب به نظر ميرسد. فهرست منابع مطالعه حاضر نشانگر اين مطلب است كه تجويز تيامين به همه بيماران همودياليزي ضرورت ندارد و فقط زماني كه ميزان ويتامينهاي محلول در آب در اين بيماران كاهش يافته باشد در حد دوز روزانه مورد نياز توصيه ميشود. تقدير و تشكر اين مطالعه تحت حمايت مالي مركز تحقيقات علوم دارويي رازي و معاونت پژوهشي دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي- درماني ايران (طرح شماره 85/ م ت) انجام شده است. نويسندگان وظيفه خود ميدانند كه از معاونت محترم پژوهشي در اين خصوص صميمانه تشكر نمايند. اين تحقيق در سال 185 در كنگره بينالمللي فيزيولوژي و فارماكولوژي (IUPHAR) در كشور چين پكن اراي ه شده است. 1- Hung SC, Hung SH, Tarng DC, Yang WC, Chen TW, Huang TP. Thiamin deficiency and unexplained encephalopathy in hemodialysis and peritoneal dialysis patient. Am J Kidney Dis 2001; 8(5): 941-7. 2- Ihara M, Ito T, Yanagihara C Nishimura Y. Wernicke s encephalopathy associated with hemodialysis: report of two cases and review of the literature. Clin Neurol Neurosurg 1999; 101: 118-21. - Ueda K, Takada D, Mii A, Tsuzuku Y, Saito SK, Kaneko T, et al. Severe thiamin deficiency resulted in Wernicke s encephalopathy in a chronic dialysis patient. Clin Exp Nephrol 2006; 10(4):290-. 4- Allman MA, Truswell AS, Tiller DJ, Stewart PM, Yau DF, Horvath JS, et al. Vitamin supplementation of patients receiving hemodialysis. Med J Aust 1989; 150(): 10-. 5- Boeschoten EW, Schrijver J, Krediet RT, Schreurs WH, Arisz L. Deficiencies of vitamins in CAPD patients: the effects of supplementation. Nephrol Dial Transplant 1988; (2): 187-9. triphosphate in pig skeletal muscle. Biochem Int 1986; 12: 85-90. 7- Miyoshi K, Esi Y, Shioda T, Kawasaki T. Evidence for in vivo synthesis of thiamin triphosphate by cytosolic adenylate kinase in chicken skeletal muscle. J Biochem 1990; 108: 267-270. 8- Bettendorf L, Peeters M, Win P, Schoffeniels E. Metabolism of thiamin triphosphate in rat brain: correlation with chloride permeability. J Neurochem 199; 19: 42-44. 9- Bettendorf L, Hennuy B, DeClarck A, Wins P. Chloride permeability of rat brain membrane vesicles correlates with thiamin triphosphate content. Brain Res 1994; 652: 157-160. 10- Shikata H, Esi Y, Koyama S, Yamada K, Kawasaki T. Properties of the thiamin triphosphate synthesizing activity catalyzed by adenylate kinase (isoenzyme 1). Biochem Int 1989; 8: 94-949. 11- Esi Y, Koyama S, Shioda T, Yamada K, Kawasaki T. Identification, purification and reconstitution of thiamin metabolizing enzymes in human red blood cell. Biochem Biophys Acta 1992; 1160: 171-178. دورة پانزدهم / شماره 60 و / 61 پاي يز و زمستان 187
12- Ishii K, Sarai K, Sanemori H, Kawasaki T. Analysis of thiamin and its phosphate esters by highperformance liquid chromatography. Anal Biochem 1979; 97: 191-195. 1- Morita M, Kanaya T, Minesita T. Simultaneous determination of thiamin and 2- (1-hydroxy ethyl) thiamin in biological materials. J Vitaminol 1969; 15: 116-125. 14- Wyatt DT, Lee M, Hillman RE. Factors affecting a cynogen bromide-based assay of thiamin. Clin Chem 1989; 5: 217-2178. 15- Sanemori H, Kawasaki T. Purification and properties of thiamin pyrophosphokinase in paracoccus denitrificans. J Biochem 1980;88:22-20. 16- Gibson S Thiamin. Gibson S, editor. Principles of Nutritional Assessment. 2 nd ed. New York: Oxford University Press; 1990, p.424. 17- Baines M, Davies G. Standards of thiamin diphosphate effect. Ann Clin Biochem 1988; 25:698. 18- Fennelly J, Frank O, Baker H, Leevy C. Metabolism of thiamin triphosphate. Am J Clin Nutr 1967;20:946. 19- Kaczmarek MJ, Nixon PF. Properties of the thiamin triphosphate synthesizing activity of adenylate kinase. Clin Chem Acta 198;10:49. 20- Bailey AL, Finglas PM, Wright AJA, Southon S. Vitamin supplementation Br J Nutr 1994;72:111. 21- Kjosen B, Seim SH. Thiamin in methods of vitamin Assay. Am J Clin Nutr 1977;0:1591. 22- Levin LM, Wei R. High performance liquid chromatographic analysis of thiamine & riboflavin in dietetic foods. Anal Biochem 1966;16:29. 2- Waring PP, Goad WC, Ziporin ZZ. Modified thiochrome procedure for the determination of urinary thiamin. Anal Biochem 1968;24:185. 24- Schlemmer W, Kammerl E. Vitamin analysis for the health & food sciences. J Chrom 197;82:142. 25- Van De Weerdhof T, Wiersum ML, Reissenweber H. Content of Thiamin Phosphate esters in mammalian tissues. J Chrom 197;8:455. 26- Berger G, Bergel F, Todd AR. Evidence for in vivo synthesis of thiamin triphosphate by cytosolic adenylate kinase in skeletal muscle. Nature 195;16:259. 27- Wielders JPM, Mink CYK. Chemical derivitization of thiamine. J Chrom 198;277:145. 28- Defibaugh PW, Smith JS, Week CM. Simultaneous determination of thiamin and its metabolite in biological fluids. J AOAC JNT 1977;60:522. 29- Sebecic B, Vedrina-Dragojevic J Oxidative derivitization of thiamin. Nahrung 1989;0:527. 0- Roser RL, Andrist AH, Harrington WH, Nation HK, Lonsdale D. A new method for detection of thiamin in plasma. J Chrom 1978;146:4. 1- Bontemps J, Philippe P, Bettendorff L, Lombet J, Dandrifosse G, Schoffeniels E. Reverse phase chromatography of thiamin esters. J Chrom 1984;07:28. 2- Weber W, Kewitz H. Analysis of thiamin with normal phase by high-performance liquid chromatography. Eur J Clin Phamacol 1985;28:21. - Bettendorff L, Grandfils C, De Rycker C, Schoffeniels E. Analysis of thiamin with reverse phase chromatography. J Chrom 1982;82:297. دورة پانزدهم / شماره 60 و / 61 پاي يز و زمستان 187 184
Determination of Thiamin Level by a Sensitive HPLC Method in Plasma of Chronic Hemodialysis Patients Downloaded from rjms.iums.ac.ir at 10:26 IRST on Tuesday September 25th 2018 *M. Motevalian, PhD I E. Souri, PhD II N. Tafreshi, PharmD III H. Jalalizadeh, PhD IV M. Mahmoudian, PhD V Abstract Background and Aim: Renal replacement therapies are usually associated with changes in trace elements and metabolism of vitamins. Multivitamins are administered routinely to dialysis patients in dialysis centers. Thiamin plasma level is a good indicator of nutritional state of the patient. In this study, a sensitive high-performance liquid chromatography HPLC method for determination of the concentration of thiamin in human plasma has developed by which thiamin level is detected in plasma of hemodialysis patients. The aim of the study was determination of thiamin blood levels in chronic hemodylysis patients in order to evaluate their need for thiamin supplements. Materials and Methods: In this experimental study, the plasma of nine Iranian patients on hemodialysis were analyzed for their thiamin levels and compared to the thiamin levels in a group of healthy Iranian subjects. The procedure was based on pre-column oxidation of thiamin to thiochrome followed by fluorescence detection. Plasma (1ml) was deproteinized with trichloroacetic acid and thiamin was extracted with diethyl ether. Then, cyanogens bromide (0. M) was added to convert thiamin to thiochrome. Samples (25µl) were applied to a Novapak C 8, 4µm (4.6 250 mm) column. The mobile phase consisted of methanol: phosphate buffer (0mM) in the ratio of 45:55 and 0.05% sodium lauryl sulfate. Data were analyzed using SPSS V1. Statistical analysis was done by t-test and One- way Anova test. Results: A precise and reproducible HPLC method was developed for determination of thiamin in plasma. The minimum detection limit was 0.2 ng/ml and percentage recovery was 85%. Inter and Intra day assay variabilities were determined for 1,5 and 15 ng/ml thiamin spikes in plasma and coefficient of variations were in the range 0.2-2.94%. The average plasma thiamin level in 10 healthy Iranian subjects was.07±0.95 ng/ml and in Iranian patients was 4.72±1.12 ng/ml and 4.29±0.67 ng/ml before and after hemodialysis, respectively. Our study has shown that the mean plasma thiamin level in Iranian patients on hemodialysis has no significant difference with its level in healthy Iranian subjects. The thiamin level also remained unchanged before and after the hemodialysis. Conclusion: The HPLC method used for determination of thiamin in plasma was sensitive, accurate, reproducible and suitable for kinetic studies of thiamin. According to our findings the thiamin level in patients undergoing hemodialysis has no significant difference with healthy subjects and it seems that dietary vitamin is sufficient for the normal functions of the body, and taking viamin supplementation is not necessary for these patients. Key words: 1) Thiamin 2) High Performance Liquid Chromatography (HPLC) ) Plasma Level 4) Hemodialysis This study has been conducted under the financial support of the undersecretary of Research of Iran University of Medical Sciences and Health services and Razi Research Institute for Pharmaceutical Science. It has also been presented in the International Congress of Physiology and Pharmacology (IUPHAR) held in Beijing China in 2006. I) Assistant Professor of Pharmacology, Faculty of Medicine, Crossing of Hemmat and Chamran Expressways, Iran University of Medical Sciences and Health Services, Tehran, Iran (*Corresponding Author) II) Associate Professor of Pharmacy, School of Pharmacy and Research Institute for Pharmaceutical Science, Tehran University of Medical Sciences and Health Services, Tehran, Iran III) Pharmacist, Azad Islamic University, Tehran, Iran IV) Assistant Professor of Pharmacy, School of Pharmacy and Research Institute for Pharmaceutical Science,Tehran Universtiy of Medical Sciences and Health services, Tehran, Iran V) Professor of Pharmacology, Iran University of Medical Sciences and Health Services, Tehran, Iran 185 دورة پانزدهم / شماره 60 و / 61 پاي يز و زمستان 187